氨基酸发酵的生产研究
摘要：对提高土壤中取得的菌株的赖氨酸生产能力进行研究，简要介绍了赖氨酸的发展现状。
关键词：赖氨酸，发酵，原生质体，基因
前言：赖氨酸的化学名称为2,6-二氨基己酸或仅，α,ε-二氨基己酸，英文名称为Lysine。有L-型和D-型两种光学异构体。赖氨酸是人和动物自身不能合成的一种氨基酸，必须从外界摄取，而植物中所
含的各种赖氨酸很少，被称为植物中第一限制性氨基酸。发酵法是当今世界上生产赖氨酸的主要方法。【1】发酵法生产赖氨酸的研究一般从两个方面入手: 一方面, 选育产酸率高的优良菌株, 这是提高发酵生产效率的主要手段; 另一方面, 寻找适宜的发酵工艺参数, 充分发挥菌种的产酸潜力。
1.选育优良菌株：
1.1原生质体融合育种：
- 培养基的选取：营养肉汤培养基（NB），发酵培养基，高渗再生培养基，原生质体稀释液，融合液，溶菌酶，青霉素G钾盐，原生质体的细胞壁再生引物。
- 菌丝体培养：将从校园土壤中取得菌株的保存液去2ul，接种于NB的液体试管中。并对菌体惊醒青霉素预处理。
1.1.3原生质体制备：经青霉素处理的菌液，4000r/min离心10分钟，去上清液收集菌体。将溶菌酶加入菌悬浮液中。最后通过离心除去残余的溶菌酶和青霉素。
- 原生质体融合
- 40%的PEG首先与1mol/cacl2按9:1混合，并与原生质体样品混合均匀，4000r/min离心10min，去除上清物，收集沉淀物。
- 细胞融合再生
- 60℃ ，加入利福平和链霉素。倒入无菌培养皿中。再加入细胞壁再生引物。通过影像接种法，将其接种到各种选择性培养基上，坚定融合子。【2】
- 诱变后筛选
从再生平板上挑取单菌落孢子接入发酵培养基中(3 mL/10 mL)试管, 30°C 培养,200 r/min, 7 d 后对发酵液进行快速分析, 利用酶标仪扫描测定赖氨酸含量。初筛高产菌株经活化后, 分别取菌株接入发酵培养基中(30 mL/250 mL 三角瓶),30°C 培养24 h, 然后各取3.0 mL 菌液加入3个发酵瓶中, 30°C 培养96 h 后对发酵液进行分析, 测定赖氨酸的含量。取其平均值, 确定高产量的优良菌株。（1）分光光度法测定赖氨酸含量, 参照itzhaki方【3】法。(2) 酶标仪高效扫描测定聚赖氨酸产量。
1.2基因重组
1.2．1二氨基庚二酸合酶基因(dapA)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶因(ppc)是菌体在赖氨酸合成代谢途径中，控制表达二氨基庚二酸合酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的关键基因。我们首先分别克隆两个基因。并使之处于一定启动子控制下。然后将dapA和ppc重组克隆到同一个载体，并转化赖氨酸发酵菌。从而提高菌体内的酶活，进一步提高赖氨酸发酵产率。
1.2.2克隆
对已知基因的克隆，只要通过PCR从基因组扩增出目标基因dapA和ppc。基因的的初步克隆和分析几乎都以大肠杆菌为宿主，将两个基因克隆岛同一载体上，用于基因克隆载体的质粒包括一个复制子、一个多克隆抗体和选择性标记。【4】
1.2.3将二氨基庚二酸合酶基因克隆到已克隆了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的质粒pPC9中的sal I位点，得到重组质粒pPCD19。酶切分析，选出正向克隆后，转化赖氨酸发酵菌2L。【5】
2.提高菌株产酸能力
2.1 赖氨酸的生物合成很有规律，【6】它不仅依赖于赖氨酸合成途径中的酶，而且依赖于驱动合成赖氨酸的碳源代谢的酶。为了提高赖氨酸产率，就要求改变碳源的供应。从而控制中间物向赖氨酸合成的转化。【7】还需补加氮源.氨水可提供部分氮源，另外还需补加其他无机氮源，主要是硫酸铵. 这是因为仅用氨水补充氮源会造成发酵液pH 值过高，而铵离子和硫酸根离子同时存在可激活谷氨酸棒杆菌中天冬氨酸激酶，解除天冬氨酸对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的反馈抑制，增强赖氨酸合成补偿代谢机制，从而达到增强赖氨酸合成途径的效果。
2.2建立了一种利用发酵液pH 信号反馈，通过流加葡萄糖、氨和硫酸铵的混合溶液，在调节发酵液pH 值的同时实现碳源和氮源自动流加，维持发酵液碳源和氮源浓度在较小范围内波动的方法。【8】
3.赖氨酸发酵发展现状
3.1发酵原料：
日本生产赖氨酸主要用糖蜜．同时用豆饼水解液作为氮源：前苏联则用甜菜糖蜜作碳源．并采用含高丝氨酸的培养液和蛋白质一维生素浓缩物水解液发酵生产赖氨酸；波兰用醋酸混合液体作碳源，用菜籽粕的酸水解液作氮源，组成培养基，产酸率达100g／L；我国则主要以淀粉水解液或甘蔗糖蜜为碳源，用毛发水解液代替豆饼水解液作为氮源发酵生产赖氨酸。【9】
3.2 国内外发酵法生产赖氨酸技术比较
目前，拥有全套成熟赖氨酸生产技术的国家并不多，只有美国、日本、中国，很多国家是采用本输出的技术。整体说来．采用淀粉或纯糖发酵，其产酸率、提取率高一些；而采用糖蜜发酵，其产酸率、提取率低一些。据介绍，国际上菌种生产水平为l2g，L 14g／L，对糖转化率45％。实际生产中，采用淀粉（或纯糖)发酵，其产酸率9％～1l％、提取率83％～87％ ，原料消耗3．2t一3．5t淀粉／t赖氨酸； 而采用糖蜜（含糖50％)发酵．其产酸率7％～9％、提取率80％～85％．原料消耗6t／t～8t／t。我国广西赖氨酸厂。采用甘蔗糖蜜发酵， 菌种产酸水平为11．4g／L，产酸率8．2％，提取率82．4％ ，接近国际先进水平
3.3应用
3.3.1食品发酵与医药
3.3.2发酵法赖氨酸生产工艺的废水处理
4.结论
- 赖氨酸发酵工艺参数优化 廖孙启(广西大学化学化工学院, 广西南宁530004)
- 微生物实验教程 周德庆主编（高等教育出版社 第二版）
- Itzhaki FR. Colorimetric method for estimating polylysine and polyarginine. Agricultural and Biological Chemistry,1972(50): 569−574.
- 微生物学 袁生主编(高等教育出版社)
【5】【6】【9】L一赖氨酸发酵生产研究进展 王均成王文风(阜丰集团有限公司 北京 100023)
【7】【8】pH 值反馈控制赖氨酸补料发酵中的碳氮源补加方法 ，田原1,2， 张 勇2，安东1， 丛 威2(1. 河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 450002；2. 中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100190)
