氨基酸发酵工艺研究
摘 要
氨基酸(amino acid)是含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称,是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位。参与蛋白质合成的常见的是20种α-氨基酸。人体所需的氨基酸,分非必需氨基酸和必需氨基酸(包括:色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和赖氨酸)。发酵指微生物分解有机物质的过程,广泛应用于农业、医药、酿造、食品及化工等方面。将发酵与生产氨基酸联系起来,可以很好的利用发酵工程的相关设备及条件控制等技术,大量、快速、方便地生产氨基酸。
关键词:氨基酸 发酵 条件控制
Abstract
Amino acids are a series of organic compounds that contains the amino and carboxyl. They are the basic unit of biological functions of the protein molecules. Those who involved in protein synthesis are mainly 20 kinds of α-amino acids. Amino acids the human body needs non-essential amino acids and essential amino acids (including: Tryptophan, phenylalanine, methionine, threonine, leucine, isoleucine, valine and lysine). Fermentation refers to the process of microbial decomposition of organic material. It is widely used in agriculture, medicine, brewing, food and chemical industry and so on. Connecting fermentation with production of amino acids, will take full advantage of fermentation equipment and technology. So that we can get enough amino acids in a high method.
Keywords: Amino acids Fermentation control of condition
一 前言
氨基酸发酵是典型的代谢控制发酵,由发酵所生成的产物——氨基酸,都是微生物的中间代谢产物,它的积累是建立于对微生物正常代谢的抑制。氨基酸发酵是以探讨氨基酸发酵工厂的生产技术为主要目的。氨基酸发酵生产以发酵为主,发酵的好坏是整个生产的关键,但后处理提纯操作和提纯设备选用当否,也会大大影响总的得率。氨基酸发酵工艺学研究的对象应该包括从投入原料到最终产品获得的整个过程,其中有微生物生化问题、生化工程问题,也有分析与设备问题。今后的发展是采用诱变、细胞工程、基因工程的手段选育出从遗传角度解除了反馈调节和遗传性稳定的更理想菌种,提高产酸;采用过程控制,进行最优化控制,连续化、自动化,稳产、高产;探求新工艺、新设备,以提高产率和收得率;研究发酵机制等问题,以便能更好地控制氨基酸这样微生物中间代谢产物的发酵。
二 本论
2.1生产菌株的选择
2.1.1 出发菌株的初筛
氨基酸发酵微生物的优良菌株多为棒状杆菌属、微杆菌属、节杆菌属和短杆菌属[1]。从自然界中筛选有产酸能力的菌株,并建立其培养条件。通常的做法是,首先找到符合生产氨基酸条件的环境,进而取样分离。例如,加入想要分离得到纤维素酶生产菌株,一般从杂草丛或落叶下的土壤中分离的效果比较好;若要分离的到双歧杆菌,一般要从新生幼儿的新鲜粪便中分离,等等。
而要分离生产氨基酸的菌株,一般是从土壤中分离,因为土壤是微生物资源的大本营,其中包含很多菌种;另外,从已知的信息中,能过用于生产的氨基酸生产菌株一般情况下,都较广泛的分布于土壤之中。
另外还有一个较方便的方法:从相关公司或机构购买相关菌株。现在有大量的公司、机构在进行生物生产,尤其是微生物生产产品,由此够得的菌株都是可靠的。
2.1.2 出发菌株的诱变育种
有土壤中分离得到的菌株。或从相关机构够得的菌株并不一定是一个很好的适于生产的菌株,一般都要进行诱变育种,以提高生产量。
2.1.2.1物理诱变
通常是指运用物理射线,例如α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外辐射以及微波辐射等。紫外线是一种最常用有效的物理诱变因素,其诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变而形成突变型。通常的做法是:15W紫外线下30cm处,然后在搅拌下照射10~70s[2-3]。
2.1.2.2 化学诱变
化学诱变除能引起基因突变外,还具有和辐射相类似的生物学效应,如引起染色体断裂等,常用于处理迟发突变,并对某特定的基因或核酸有选择性作用。化学诱变剂主要有:烷化剂、核酸碱基类似物、抗生素等。例如亚硝基胍(NTG)、硫酸二乙酯(DES) 通过烷化基团使DNA分子上的碱基及磷酸部分烷化,DNA复制时导致碱基配对错误而引起突变[2-3]。其主要做法是将菌悬液(108cfu/ml)与处理试剂混合一定时间,然后迁出处理试剂影响,从而得到诱变产物。然后根据相应的方法筛选得到较优的诱变菌株。
2.1.2.3 利用分子技术进行优化
这种方法主要是指利用基因工程的手段,将目的基因通过各种方式,如转化、转染、接合转移、转导和细胞融合[3-4]等方法转移进入氨基酸工程受体菌体内,使其可以高效表达目的基因,提高产物产量的一种方法。这种方法的主要步骤是:首先鉴定出目标代谢产物的生物反应过程中主要有哪些功能性酶;然后找到找到相关酶基因,利用基因工程手段进行改造,以使其生产出的酶具有较高的酶活、稳定性等等性质;将改造好的酶基因与一系列调节基因适当组合,移入受体菌株;寻找适当条件,是目的基因高效表达。
2.1.3 菌株特性
菌株特性主要是指菌株的生长的相关的特点,例如生长曲线,适于生长的碳源、氮源,生长必须的生长因子、激素,微量元素如钠、钾、铁等,可以很好的计划生产时需加入的物质,以便更好地有利于菌株的生产。
2.2中间过程的控制
2.2.1 培养基的选择
2.2.1.1碳源
碳源是构成菌体和合成氨基酸的碳架及能量的来源,能构成细菌和真菌干重的50%左右。不同氨基酸产生菌除能利用葡萄糖外,对蔗糖、果糖、麦芽糖和醋酸等的利用能力各不相同[2]。例如,赵建云以L-组氨酸产生菌WH1263为实验菌株,得到的结果为葡萄糖作为WH1263发酵生产L-组氨酸的最佳碳源,并且在葡萄糖含量为100g/L的发酵培养基中,产酸量最大,达到9g/L[2]。而张久丽在以其实验室的菌株Ly-H6U79-28(赖氨酸生产菌株)为实验材料时,发现同样以葡萄糖为最优碳源,但最优葡萄糖浓度变化为20%时,赖氨酸产量达到最大,为63.2g/L,葡萄糖转化率达到46.2%[5]。王晶以Bacillus cereus WJ44摇瓶发酵产生支链氨基酸转氨酶的过程进行优化,发现葡萄糖作为碳源时,菌体生长情况比其它四种常规碳源要好,产酶量则明显高于其它碳源;而最优浓度是20 g/L的葡萄糖添加量[6]。
由以上及其它文献参考可知,葡萄糖是生产氨基酸的最优的碳源,但其具体浓度,需要有不同的菌种具体实验而得;各个菌种的性质不尽相同,其利用葡萄糖的效率也不尽相同[2、5-8]。
2.2.1.2氮源
氮源是合成菌体蛋白质、核酸等含氮物质和合成L-组氨酸氨基的重要组成成分。氮源分为无机氮(尿素、液氮、碳酸氢铵、硫酸铵等等)和有机氮(蛋白质、胨、氨基酸或玉米浆、豆饼水解液等等),一般菌体利用无机氮比较迅速,利用有机氮比较缓慢。发酵培养基一般采用含有快速和慢速利用的混合氮源,如氨基酸发酵中一般采用铵盐和豆饼水解液[2]。赵建云以L-组氨酸产生菌WH1263为实验菌株,得到的结果为硫酸铵作为WH1263发酵生产L-组氨酸的最佳氮源,并且在氮含量为35g/L时,达到最大产量[2]。张久丽在以其实验室的菌株Ly-H6U79-28(赖氨酸生产菌株)为实验材料时,发现同样以硫酸铵为最优氮源,氨基酸产量达到45.1g/L[5]。但在王晶以Bacillus cereus WJ44摇瓶发酵产生支链氨基酸转氨酶的过程进行优化时,发现菌体利用有机氮产酶的情况则明显优于无机氮,蛋白胨和鱼粉尤为突出,结合菌体生长及产酶情况,蛋白胨是比较合适的氮源,并且在蛋白胨浓度为15 g/L时,氨基酸产量达到最大值[6]。
由以上及其它文献参考可知,氮源的利用要比碳源的利用复杂一些,同是生产氨基酸的菌种,因为菌种的不同而造成最佳氮源的区别,并且发现大多数的微生物以无机氮源为主要利用原料,但也有部分菌种以有机氮源为速效氮源[2、5-8、9]。
2.2.1.3无机盐
无机盐主要是指磷酸盐、硫酸盐、钾盐、微量元素等等。一般在低浓度时对微生物生长和产物合成有促进作用,在高浓度时常表现出抑制作用。因此在生产中要通过试验预先了解菌种对无机盐和微量元素的最适需求量,以稳定和提高产量[5]。磷盐既为DNA的合成提供了原料物质,同时又是细胞壁的组成部分,不足时糖代谢受抑制[2]。金属离子对微生物代谢产物的形成影响很大。1963年Suzuki等报告,在较高浓度Mn2+、Fe2+和Zn2+等金属离子存在下,某些细菌可由葡萄糖积累D-核糖。如果不添加这些金属离子时,则积累D-核糖-5-磷酸和5-磷酸核糖焦磷酸[7]。赵建云以L-组氨酸产生菌WH1263为实验菌株,当K2HPO4·3H2O为1.25g/L时组氨酸的产量达到最大;而且通过正交试验,得到较高浓度的金属离子对组氨酸的合成起抑制作用,发现金属离子对积累组氨酸有协同增效作用,当培养基中Zn2+、Mg2+、Fe2+和Mn2+浓度分别为2.2mmol/L,1.8mmol/L、1.2mmol/L和0.27mmol/L时,组氨酸产量达到最大[2]。张久丽发现以菌株Ly-H6U79-28(赖氨酸生产菌株)为实验材料时,最优组合为0.05%的MgsO4·7H2O,K2HPO4的浓度为0.1%,CaCO3为5.5%[5]。王晶在以Bacillus cereus WJ44实验发现,菌体干重在KH2PO4的添加量为5 g/L时达到最大,而酶活会在添加量大于3 g/L时呈下降趋势;MgSO4·7H2O浓度大于0.7 g/L时,菌体生长会受到抑制,酶活则在浓度大于0.5 g/L时呈下降趋势[6]。
由以上及其它文献参考可知,无机盐在微生物的培养过程中是不可或缺的,它们可以通过多种途径影响微生物的生长。其利用效率与碳源和氮源有相似之处:不同的菌种利用无机盐的最佳形式与浓度有很大的区别[2、5-8]。
2.2.2 控制发酵的条件
2.2.2.1 pH
溶液的pH深深地影响着溶液的化学性质,它们直接影响溶液的氧化还原电位,因而影响胞外发生的任何反应、极性分子的离子状态、电解质的离子状态,还可影响复杂分子的结构[2]。它主要①影响酶的活性,当pH值抑制菌体中某些酶的活性时,会阻碍菌体的新陈代谢;②影响微生物细胞膜所带电荷的状态,改变细胞膜的通透性,影响微生物对营养物质的吸收和代谢产物的排泄;③影响培养基中某些组分的解离,进而影响微生物对这些成分的吸收;④pH值不同,往往引起菌体代谢过程的不同,使代谢产物的质量和比例发生改变[5、9]。
赵建云以L-组氨酸产生菌WH1263为实验菌株,设置初始pH分别为6.0、 6.5、7.0、7.5、8.0,发现pH7.0时L-组氨酸含量最大,达到10.2g/L[2]。王晶在以Bacillus cereus WJ44实验,进行pH 6.0~pH 10.0的范围内调节转氨反应底物溶液的起始pH,于40℃进行转氨反应6 h,却发现最适平pH为9.0[6]。张久丽用HCI、NaOH调节培养基初始pH为4.5-8.5,比较Ly-H6U79-28的赖氨酸产量,发现最适pH亦为7.0[5]。
2.2.2.2温度
微生物的生长和产物的合成都是在各种酶催化下进行的,温度是保证酶活性的重要条件,发酵过程中最好的生物酶活性一般仅能在很小的温度范围内维持,因而需要有效地控制温度,使其适于生物生长和目的产物的生成[5];微生物细胞内的温度与其所处的环境温度相同,而且就任何化学反应而论,微生物所有的活动对环境温度都是敏感的[2]。
尚常发等以新鲜蛋鸡粪为原料进行沼气发酵试验,发现利蒲发酵罐中,随着温度从22℃上升到30℃,沼液的氨基酸含量逐渐增加,分别从0.864, 1.182, 1.885, 2.049 mg/g增加到2.154mg/g,上升的幅度很大,整个曲线只在24℃时出现1个明显的转折点, 26℃以后仍在上升,但上升的幅度比较平缓;而在露天发酵试验时,温度的变化基本不影响3种样液的氨基酸含量[10]。
2.2.2.3接种量
接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。接种量的大小决定于生产菌种在发酵过程中生长繁殖的速度,直接影响发酵周期[2、5]。一般来说,接种量大,则延滞期短,反之则长[11]。但接种量过大,会因菌数剧增过快和随接种而移入过多的代谢废物,导致菌种容易衰老,不利于高产氨基酸[3]。因此,确定最适接种量是十分必要的。张久丽以Ly-H6U79-28菌株分别测定接种量为2%,4%,6%,8%,10%和12%的赖氨酸产量,发现接种量达到8%-10%时,赖氨酸产量相差不大:接种量为8%时,赖氨酸产量为74.59/L;接种量为10%时,赖氨酸产量为70.59/L;但当接种量为12%时,赖氨酸产量却为 60.29/L,这是因为接种量过大,往往使菌体生长过快,营养物质消耗过快,发酵液粘度大,菌体早衰[5]。而赵建云通过对发酵条件的研究,获得最佳摇瓶分批发酵培养方式的接种量为6.70%[2]。与此相比,王晶测定的结果为:BCAT活力则在接种量为3%时达到峰值,接种量继续增加酶活力出现明显下降[3];并且邵丽测定其试验菌株的最佳接种量亦为3%[11]。
2.2.2.4发酵时间
发酵周期的判断,对提高产量和经济效益都是很重要的。发酵过程中产物的合成,有的随菌体生长而增加;有的则与菌体生长无明显关系。但无论哪种类型的发酵,到了一定时期,由于菌体的衰亡,分泌能力下降,使得产物合成能力下降,甚至会由于菌体自溶释放出分解酶类破坏合成的产物[5]。
2.3产物的分离
从发酵液中提取、精制的氨基酸应达到标准的纯度,纯度要求较低的饲料用的氨基酸为98.5%;而医药用的氨基酸达99.8%以上,实质达到100%。相对于纯氨基酸来说,氨基酸的发酵液中除含有目的氨基酸以外,还含有微生物菌体、培养基成分以及微生物代谢副产物等多种不纯物,例如核酸、肽、蛋白质、有机酸等。利用这些不纯物与目的氨基酸在物理、化学性质的差异进行提取精制[12]。
目前,常见的氨基酸分离与纯化的方法有:沉淀剂分离法、吸附法、离子交换法、膜分离法、萃取法[13-14]、结晶法[12、14]等。
2.3.1沉淀法分离氨基酸
沉淀法分离氨基酸主要有特殊试剂沉淀法、等电点沉淀法和有机溶剂沉淀法等方法[13-15]。
特殊试剂沉淀法是指某些氨基酸可以与一些有机化合物或无机化合物结合,形成结晶性衍生物沉淀,达到与其它氨基酸分离的目的,例如较为成熟的工艺有:精氨酸与苯甲醛在碱性和低温条件下,可缩合成溶解度很小的苯亚甲基精氨酸,将沉淀用盐酸水解除去苯甲醛,即可得精氨酸盐酸盐;亮氨酸与邻-二甲苯-4-磺酸反应,生成亮氨酸的磺酸盐,后者与氨水反应,得到亮氨酸。组氨酸与氯化汞作用,生成组氨酸汞盐的沉淀,再经硫化氢的处理就可得组氨酸;等电点沉淀法是指根据氨基酸的等电点不同,在等电点时,氨基酸分子的净电荷为零,氨基酸在溶液中的溶解度最低,有利于氨基酸分子的彼此吸引而形成结晶体沉淀下来,例如从生产半胱氨酸的废母液中回收胱氨酸。半胱氨酸在水溶液中的溶解度比较大,而胱氨酸在等电点处溶解度很小;调整溶液的pH,再加入H2O2将半胱氨酸氧化成胱氨酸,就可以形成沉淀达到分离的目的;有机溶剂沉淀法是指利用某种有机溶剂使需要提取的物质在溶液中的溶解度降低而形成沉淀,例如一般丙酮沉淀氨基酸的速度最快量也最多,丙酮挥发性强,选择丙酮作为沉淀剂,沉淀完成后可以回收并重复利用。
2.3.2吸附法提取氨基酸
吸附法是利用适当的吸附剂,在一定的PH条件下,使发酵液中的氨基酸被吸附剂吸附,然后再以适当的洗脱剂将吸附的氨基酸从吸附剂上解吸下来,达到浓缩和提纯的目的[13]。一般苯丙氨酸与酪氨酸通过活性炭柱层析提取。具体做法是:先以水洗,串第二支柱。用1mol/L氨水洗脱,分部收集,合并含酪氨酸部分,至酪氨酸转阴。再以乙醇洗脱,分部收集,至苯丙氨酸转阴,合并含苯丙氨酸洗脱溶液。最后通过浓缩结晶及重结晶的过程,即可得到纯度较高的苯丙氨酸与酪氨酸[16]。
2.3.3离子交换法提取氨基酸
离子交换法是利用离子交换剂对不同氨基酸吸附能力的差异进行分离的方法。氨基酸为两性电解质,在特定条件下,不同氨基酸的带电性质及解离状态不同,故同一种离子交换剂对不同氨基酸的吸附力不同,因此可对氨基酸混合物进行分组或实现单一成分的分离[13、17、18]。味精厂采用强酸性阳离子交换树脂对谷氨酸阳离子进行选择性吸附,以使发酵液中妨碍谷氨酸结晶的残糖及糖的聚合物、蛋白质、色素等非高子性杂质得以分离。打这种方法也有缺点:因为其原理是根据不同物质的电荷进行区分的,所以当氨基酸的性质较为相似时,会比较难以分离;分离过程中流速较慢,要求设备体积大,等等[17]。
表:主要氨基酸的PI值[13]
2.3.4 膜分离法
膜过滤法可以实现混合溶液的分离是因为在膜和溶液的界面处存在以下机理:由于亲水性等原因所引起的选择性透过;筛分效应:待分离物质分子的直径大于膜孔的直径,将被截留,反之则透过;电荷效应(Donnan效应):若膜表面带与待分离物质同种电荷,则会产生静电排斥作用,反之则会产生吸引作用[19]。主要膜分离技术为微滤、超滤、反渗透和电渗析法。除电渗析法外,所有膜分离法的驱动力为压力梯度。微滤膜和超滤膜的分离原理是筛孔机械装置,由于膜的细孔小,溶质和溶剂透过,而大的悬浮物、高分子物质不能透过而被浓缩。用微滤膜过滤菌体要需用性能高的膜[12]。因为膜的孔径极小,因此在进行膜分离时,之前都要进行除菌步骤,以防止菌体阻塞滤膜。
三 结论
任何发酵工业的基础,都是必须有一株活性较高的菌株作为生产菌株,一提高产量与收入。提高菌株活性的方法,较为传统的是物理诱变与化学诱变,即通过各种射线或生化试剂对菌株诱变,但诱变方向不确定;另外还有的方法为对菌株进行基因工程改造,有选择、有目的的改造菌株。
发酵的中间控制过程是发酵工业的关键一环,中间调控是否得当,直接影响菌株的生存与产物的形成。其中较为重要的因素分别为碳源、氮源、无机盐、生物素、温度、pH、接种量、溶解氧、发酵时间等等方面。
发酵产物的提取是生物工业的一大难题,因为发酵醪中的成分十分复杂,含有底物,产物及微生物残体等等,任意因素都会影响提取的纯度。因此要根据产物的特性,即不同特点进行依次分离,选择适当的分离程序与方法。
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