L-乳酸脱氢酶(L-Lactate Dehydrogenase,L-LDH)是发酵生产L-乳酸中催化丙酮酸转化成L-乳酸的关键酶
本文以干酪乳杆菌G-02(Lactobacillus casei G-02)基因组DNA为模板,克隆得到L-LDH基因(ldhL),经序列分析后将其连接到表达载体pET-28a(+)上,构建成重组质粒pET-ldhL,并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,实现ldhL基因的表达,30℃加入终浓度0.4 mmol/L的IPTG诱导表达,采用Ni-NTA凝胶填充层析柱纯化目的蛋白,样品经SDS-PAGE分析,约在39 kD处出现显著的特异性条带,重组L-LDH的比酶活为1722 U/mg,回收率为59.8%,纯化倍数达3.33倍
#R##N##R##N##TAB#对表达的L-LDH生物学特异性研究显示:最适反应温度为40℃?45℃;在45℃以下能维持较高酶活;果糖-1,6-二磷酸(FBP)为别构激活剂,使最适pH向中性方向偏移(pH为6.6?6.8),Mn~(2+)可拓宽最适酶活pH范围;L-LDH在酸性环境中较稳定,维持在75%以上;酶催化反应最适NADH浓度为0.174 mmol/L,最适丙酮酸浓度为20 mmol/L,未添加激活剂时,底物[S]对V的动力学曲线是S形曲线,而添加激活剂后,动力学曲线变成了双曲线;Mn~(2+)、Ca~(2+)和Mg~(2+)对L-LDH有激活作用,而Zn~(2+)对L-LDH有抑制作用
当反应体系中乳酸浓度小于0.22 mol/L时,酶活量仍保持较高,当乳酸浓度大于0.44 mol/L时,酶活力大幅度下降
#R##N##R##N##TAB#以ldhL基因和大肠杆菌-乳杆菌穿梭质粒pMG36e为基础构建重组质粒pMG-ldhL,优化电转化条件,确定最佳电转条件为电压1.5 kV,时间为2.0 ms,将重组质粒转入初始菌株L.casei G-02,鉴定获得重组菌L.casei (pMG-ldhL),培养重组菌表达目的蛋白,与对照初始菌株相比,约在37 kD处出现明显蛋白条带,但重组菌表达的目的蛋白量较低
#R##N##R##N##TAB#在随后进行的摇瓶发酵试验中发现,初始菌L.casei G-02最终积累L-乳酸94 g/L,重组菌L.casei (pMG-ldhL)的L-LDH通过过量表达,酶活力大幅度提高,最大酶活由初始菌的23 U/mL提高到95 U/mL,是初始的4.1倍,但是重组菌乳酸产量提高微弱
在发酵培养基中添加激活剂FBP(4 mmol/L)、Mn~(2+)(3 mmol/L)和合成NADH的前体烟酸(8 mg/L),实验结果显示,重组菌L.casei (pMG-ldhL)最终积累乳酸107 g/L,对糖转化率为91%,乳酸生产强度达到2.67 g/(L·h),相对初始菌株L.casei G-02分别提高了14%、11%和36%
添加激活剂和烟酸后,葡萄糖消耗速度明显加快,发酵周期由48 h缩短到40 h
参考文献
