ABSTRACT
研究了以瘤胃液作为水解微生物的来源，对原生菌群的预处理进行了研究。在生物反应器中首次丰富了瘤胃培养的水解酶活性。然后，利用富集培养基，研究了微藻对瘤胃液体比(S / X)的影响，并研究了甲烷的后续生产。S / X 0.5的比率显示最好的水解效率(29%)达到第二阶段过程中甲烷产量193毫升CH4 g鳕鱼−1。处理时间(预处理加甲化)仅7天。在富集过程中所选择的主要的反刍性水解细菌主要是梭菌、蛋白酶体和假单胞菌。
1 .介绍
化石燃料的缺乏、气候变化和环境的恶化，推动了能源生产中清洁技术的搜索、开发和实施。生物质能是一种广泛使用的可再生能源(Demirbas,2009)。从这个意义上讲，从微藻中获得的第三代生物燃料具有优势，比如土地使用较低，而生物燃料则更少，而且可能会使二氧化碳减排和废水处理成为可能。微藻是在水生环境中生长的单细胞微生物，通过光合作用将二氧化碳、水和阳光转化成脂类、碳水化合物和蛋白质，从而产生比陆地作物更大的产量(Li et al .，2008)。微藻的定义通常包括所有简单的单细胞和多细胞光合微生物，包括原核微藻(蓝藻)和真核微藻(绿藻、红藻和硅藻)(布伦南和欧文斯德，2010)。
许多利用微藻作为基质的技术都集中在生物柴油的生产上;然而，由于下游加工成本太高，生物柴油的大规模生产是有限的。脂质提取必须完成从干重,这个干燥过程消耗50 - 80%的整个生产过程所需的能量(González-Fernández et al .,2012)。厌氧- g摄入微藻是微藻生物量能量回收最具前景的技术之一，在20世纪50年代进行了第一次研究(Golueke et al .，1957)。在这项研究中,一个财团的微藻(小球藻、栅藻)直接进行厌氧消化,达到产量0.17 - -0.32 L CH4 g-volatile所以,盖子(VS)−1。微藻的低生物降解性是由于其细胞壁的成分,富含纤维素和半纤维素(González-Fernández et al .,2012 b)。为了提高微藻生物量的甲烷回收，预处理通常采用化学或酶解。用于水解微藻生物量的酶主要是葡萄糖酶、糖苷酶、肽酶和脂肪酶。这些酶已经单独使用(Mahdy et al .，2016)和酶调鸡尾酒(Ciudad et al .，2014;马迪等人，2016年，2014年。使用后一种策略，Ciudad等人(2014)取得了最好的气态生物燃料产品之一。在这项研究中,微藻类的细胞壁Botryococcus braunii di -手势使用酶提取(木质素分解酶)获得Anthracophyllum变色,白腐菌,生产521毫升的CH4 g-VS−1,代表90%的厌氧生物降解性。尽管酶预处理对微藻生物量有明显的优势，但由于其高成本和缺乏可重用性，纯酶的使用是过程中的一个限制因素(他等人，2016年;妈妈̃oz et al .,2014)。
为了探索更有成本效益的方法，在微藻生物量的预处理中，提出了利用水解mi - croUNK培养的方法。使用这种方法,Muñoz et al。(2014)报告的使用与水解细菌活动执行预处理Nannochloropsis gaditana生物量,提高甲烷产量的158%。他等(2016)对小球藻生物量进行预处理，结果与生生物量相比增加了22%的甲烷产量。最近，carrillo - reyes等人(2016)对微藻生物量的生物预处理方法进行了综述，并建议使用天然水解细菌组合，如在白蚁和反刍动物消化道中发现的。
瘤胃是反刍动物消化道的第一个腔室，被复杂的厌氧微生物种群所殖民，其中包括细菌、原生动物、真菌和古生菌。属纤维杆菌属和瘤胃球菌是瘤胃中最丰富的细胞溶解细菌，并具有降解木质部的能力。其他的反刍动物都有淀粉酶活性(如反刍动物和蔗糖素)，而拉乔诺螺属的种类能够消化果胶。瘤胃微生物可降解木质纤维素物质生成短链脂肪酸和沼气(22 - 29% me -烷)作为代谢的主要产物(Van Soest,1994)。从这个意义上讲，最近的研究报告指出，利用瘤胃微生物在一个步骤过程中从微藻生物量中产生甲烷。Gimé游泳et al。(2017)利用瘤胃液体培养液的半连续从栅藻生物质甲烷产量,实现甲烷产量214毫升CH4 g-chemical需氧量(COD)−1液压和固体保留时间31,100天,re - spectively。此外，Aydin et al .(2017)使用一种从反刍液中分离出的水解真菌，用于颗粒无氧污泥的生物增强。与无真菌的厌氧污泥相比，后者的工作增加了41%，使用了pluviali血液球菌作为基质。这些先前的研究证实了反刍微生物的潜力，以增加从mi - cro藻类生物量中甲烷的恢复。然而，没有任何报告表明使用反刍性液体作为预处理步骤，可以改善在产甲烷步骤前细胞壁的破坏速率。在此基础上，对其作用参数进行评价，如基质对接种物的比值，以及对反刍社区的理解，都是不正确的。
因此，目前的研究目的是研究利用反刍流体作为一种水解微生物的来源，以进行原生微藻的预处理(本质上是Senedesmus)。从这个意义上说，反刍类的水解酶活性首先在生物反应器中得到了丰富。然后，利用富集培养的方法，研究了mi - cro藻类对溶解氧的影响，并对甲烷的次生产量进行了研究。另外，利用下一代测序技术，对微藻培养基中含有硒的瘤胃细菌和内源性细菌进行了16S rDNA鉴定。
2。材料与方法
2.1。微藻生物量和反刍流体
2.1.1。原生微藻财团
微藻生物质用作基质是本地财团从湖位于地方,墨西哥(20°42 07.0′′′N,100°27′36.7′′W和海拔1900米)。利用塑料管袋(8 L)作为反应器，丰富了微藻的培养。一旦达到理想的微藻密度(0.74，吸光度为685 nm);或0.58 g和L−1),它是由离心浓缩(4500 rpm,10分钟)。反应堆被充气的恒流1 L分钟−1(0.035%二氧化碳)使用石头扩散器和维护一个明暗12×12 h。提供的光线54 W霓虹灯灯(LT 300 Extech仪器,美国),光强度的100μmol−2 s−1(Cea-Barcia et al .,2014)。由光学显微镜(Leica DM500，日本)和直接计数在0.1 mm的Neubauer腔中，根据Wehr和鞘(2003)的方法进行直接计数。考虑到每毫升的细胞数量，确定的主要属为Scenedesmus(98%)，Keratococcus(1%)。
2.1.2。瘤胃液体
为细菌菌种的源，3 L的反刍动物
内容取自一个被模拟的成人caw(国家林业与农业研究所，墨西哥的Queretaro)。前的早上瘤胃液体收集牛喂养和保存在40°C到它的使用。在使用之前，反刍的液体是液化的，以确保均匀化，并且用N2来维持还原介质。典型的VS /总固体(ST)的比例为0.73,平均含量为0.05 g TS(mL瘤胃液体)−1。
2.1.3。瘤胃微生物水解活性的评价
以微藻为底物，初步评价了瘤胃流体的水解能力，进行了7天的间歇试验。一个生物反应器(Applikon生物反应器系统,荷兰)使用100 rpm的不断搅拌,在40°C,和保持pH值为7,在厌氧条件下。反应器接种20%(v / v)瘤胃液体和3.5 g和L−1微藻。每24小时取一次样品，评估羧甲基纤维素酶(CMCase)、木聚糖酶和淀粉酶的胞外酶活性。在这方面,和随后的实验中报道麦克杜格尔(1948),这是类似反刍动物的唾液成分,和反面——保留的(mg L−1)(NH4)2 so4,1300;K2HPO4,2040;NaHCO3,400;氯化钠,80;MgSO4·7水,19.2;摘要·7水,1.1;氯化钙,8;KH2PO4 40。
2.1.4。厌氧污泥
在甲烷生产实验中，用一种发酵工业反应堆获得的中温厌氧污泥作为接种物。TS的内容和VS培养液的28 g L TS−1和19 g和L−1,分别。
2.2。实验设计
2.2.1。在瘤胃中富集水解细菌
在120毫升的玻璃瓶中，用80毫升的工作容积进行瘤胃液的富集;顶部空间净化与N2 15秒,然后瓶子在40°C的环境用颤抖的7天的100 rpm。两种微藻浓度(3.5和7 g L TS−1),和两个碳源(CMC,羧甲基纤维素和木聚糖1 g L−1)积极控制测试。ne - gative控制,微藻(3.5和7 g L TS−1)没有瘤胃液体,和一个示例只包含瘤胃液体(0.5 g L TS−1)eval - uat。进行了三次接种。第一接种0.5 g L TS−1瘤胃液体添加到瓶中。第二和第三的惯用语进行了转移8毫升的内容从第一个瓶子到下一个,音量调整到80毫升(0.05 g L TS−1)。在第二和第三个试验中，微藻浓度和矿物培养基与前一个- periment相同。末尾的测试中,生物质采集标本和储存在−20°C的后续描述细菌社区。所有评估的条件都是一式三份。
2.2.2。初始底物对甲烷生产的菌体比(S / X)的影响
2.2.2.1。microalgal生物质预处理。不同初始S / X比率(0.3,0.5,1和2)评估通过改变初始微藻TS浓度和保持瘤胃液体不变5 g L TS−1。此外,控制只包含瘤胃液体或使用微藻(在5 g L TS−1)。试验是在玻璃液瓶中分批培养，使用与浓缩实验中描述的相同体积、温度和混合(2.2.1节)。采用含酸性溶液的倒置试管(pH < 2)，对气体的生产进行了每日定量的量化，试验结束时，以每分钟3500转的离心率，将可溶性馏分恢复到10分钟，并进行了表征。生物样本存储在−20°C作进一步鉴定细菌的社区。所有的测试都是一式三份。
2.2.2.2。甲烷生产批量测试。利用从不同的S / X比值的预处理得到的可溶性组分，进行了间歇培养试验以评价甲烷的产生。产甲烷菌(8 g L TS−1)被添加到玻璃血清瓶30 ml的工作容积。覆与N2气体净化15秒,然后文化孵化与常数35°C混合在100 rpm。测试一式两份。对照组在平行的情况下，只含有厌氧污泥，以评估内源性呼吸。本文采用液相色谱法测定了液相驱替的生物气液，并对其组成进行了色谱分析。
将实验数据与修正后的Gompertz Eq .(1)相结合，对甲烷生产进行了动力学分析。
2.71828⎡⎛∗征求(λ−t)⎞⎤M(t)= Mmax∗exp⎢−exp⎜M + 1⎟⎥
⎣⎝马克斯⎠⎦(1)
Mmax(mL CH4)是产生的最大甲烷量;征求(mL CH4 h−1)是最大的甲烷产率;λ(h)的时间延迟期指数之前生产的甲烷;t(h)是孵化时间(He et al .，2016)。甲烷产量、Y(mL CH4 g鳕鱼−1),被消耗的评估将Mmax鳕鱼。
2.3。监测和分析技术
2.3.1。水解活动
测定了收集后和试验样品(2.1.3节)后的反刍流体的水解活性。每个样品的可溶性部分在离心10min后立即恢复到9200g。接下来,0.1毫升的可溶性部分是孵化1 h与每个基质在40°C,包括CMC、木聚糖和可溶性淀粉,专门评估CMCase,木聚糖酶和淀粉酶活动,分别。测定了葡萄糖、木糖和麦芽糖(1959年)释放葡萄糖、木糖和麦芽糖等反应混合物的还原能力。表达的不同的酶的活动是国际单位(IU)和定义为酶的数量每分钟产生还原糖μmol之一。
2.3.2。细菌社区的特征
2.3.2.1。DNA提取。从磷酸盐缓冲液中的瘤胃流体样本中提取基因组DNA，在富集实验结束时提取样本，并对S / X比值进行评价(第2.2节)。DNA提取进行了使用PowerSoil®DNA隔离设备(美国该款)根据制造商的指示。通过在琼脂糖上染色的琼脂糖凝胶染色(1%)，用纳米级的2000c(美国Thermo科学，美国)测定了DNA样品的完整性和浓度。DNA被提交给研究和测试实验室(RTL,Lubbock,USA)，焦磷酸测序是使用罗氏公司的FLX平台进行的。使用引物28 F(GAGTTTGATCNTGGCTCAG)和388 R(TGCTGCCTCCCGTAGGAGT)扩增16S rDNA基因的v1 - v2区。
2.3.2.2。454焦测序结果分析。利用QIIME软件对这些序列进行了分析(Caporaso et al .，2010)。采用USEARCH算法(Edgar,2010)，对序列中的前缀进行脱除，并以4%的序列散度进行聚类。OTUs(操作分类单元)的选择是使用UPARSE算法完成的(Edgar,2013)。使用在de novo模式下执行的UCHIME软件执行嵌合体分析(Edgar et al .，2011)。在RDP分类器中，通过对从NCBI数据库中提取的高质量序列进行比较，对每个OTU的分类分类进行了一致性排序。
2.3.2.3。分析确定辣子鸡。为了更好地理解最丰富的OTUs，并在不同的治疗方法中比较它们的丰度，使用RStudio v3.3.2(RStudio Team,2016)构建了一个热图。用“g地块”和“RColorBrewer”包装，以及功能热图来生成热图。2(Neuwirth,2014;警告et al .,2016)。
2.3.3。分析方法
用气相色谱仪分析了沼气的组成
SRI 8610C(美国SRI仪器公司)配备了一个热con
韧性检测器(TCD)和两根钢柱(长度为2米，长度为0.79 mm)
直径)。喷油器、柱和检测器的温度
分别是90年、110年和150°C。氮作为承运人−1
102
气体流量为20毫升。采用气相色谱仪(Agilent Technologies 7890B,USA)对挥发性脂肪酸(醋酸、丙酸、丁酸、异丁克、异戊二酸、己酸)和醇(乙醇和丁醇)进行了分析，并配以hp - ffap柱和火焰电离检测器(FID)。注入器和检测器tem - peratures保持在190°C和210°C,分别。列温度维持在60°C 1.5分钟,然后增加到90°C的速度15°C分钟−1;温度随后——有皱纹的170°C的速度25°C分钟−1和4分钟。氮气作为载气的流量2.5毫升分钟−1。
根据标准方法测定了VS、TS和COD的浓度(APHA et al .，2005)。碳水化合物以苯酚-硫酸法量化，以d -葡萄糖为标准(DuBois et al .，1956)。减少糖被Miller方法(Miller,1959)量化，使用葡萄糖，木糖和麦芽糖作为标准，这取决于酶的活性。采用洛瑞方法(Lowry et al .，1951)，以牛血清白蛋白为标准，量化了蛋白质的集中性。
3 .项目结果与讨论
3.1。瘤胃微生物的水解活性
为了验证在微藻存在下，瘤胃水解菌活性的假设，进行了间歇实验。通过纤维素(60%)和半纤维素(40%)在Scenedemus细胞壁(Takeda,1996)中，观察到瘤胃微生物的水解活性，这是目前使用的原生菌群中主要的微藻。24小时后——cubation瘤胃液体的microalgal生物量、CMCase和木聚糖酶的活动减少了92%和85%,分别为(从83年到6 IU CMCase L−1,从158年到22 IU L−1木聚糖酶)(图1)。酶活性的降低可以解释为在此期间微生物群落的变化。在这方面，Gijzen等人(1986)发现，在接种了含有瘤胃液体的连续系统降解木质纤维素材料后，原生动物的数量明显减少，与细菌不同的是，主要是通过细胞外酶的作用来实现纤维物质的降解。给出的淀粉酶活性略有增加96 h后,显示最多12.72 IU在144 h L−1。这个活动可能是由于细胞内淀粉的可用性通常是发现在微藻细胞壁水解后释放。在144 h中观察到的木聚糖酶和淀粉酶活性的增加可能与一种缓慢而准确的释放半纤维素有关。
Lazuka et al。(2015)评估的carbohydrolase活动瘤胃液体使用小麦秸秆作为衬底在35°C,一批文化报告CMCase和木聚糖酶活动的40和810 IU L−1,分别远高于使用微藻本研究中观察到的值。小麦秸秆(26%)和微藻(9%)之间的半纤维素含量差异可以解释水解活性的差异。此外，Scenedesmus在多糖细胞壁中有一个外层，它是由孢子素组成的，它是一种木质素类化合物，由羟基化脂肪酸和酚类化合物组成，对化学和生物攻击有抵抗作用(Staehelin和pickettg -堆，1975)。考虑的桀骜不驯,lignin-like外层细胞壁的栅藻,降低初始carbohydrolase活动表明,水解文化必须首先水解前孢粉素结构的增溶多糖(纤维素和半纤维素),允许ac -转运储备多糖(淀粉)和其他细胞内的内容。
3.2。通过重复的批培养来丰富瘤胃微生物
摘要在木质纤维素材料(Chang et al .，2010)的研究中，通过重复的分批培养技术，成功地将水解微生物的富集应用到具有水解能力的瘤胃微生物中。
通过xylan和CMC的阳性检测结果表明，木聚糖酶活性占主导地位。在接种后的三次接种中，每接种一次的木兰消耗均高于95%，而在第一次接种和第三次接种后，CMC消耗分别为1.5%和5%。最大的特定底物利用率(qsmax)木聚糖从第一到第三增加3.3倍,oculations(从0.50到1.60 g木聚糖g VSS−1 d−1);在CMC con -文化,是否是qsmax增加3.8倍(从0.006到0.022 g CMC g VSS−1 d−1)。这些结果证明了水解微生物的富集。Chang et al .(2010)报告说，通过使用纳皮尔草作为底物，通过同样的策略获得的一个bac - terial rumen财团能够降解27%的半纤维素和2%的纤维素。与纤维素不同的是，木质部是一种产生非晶结构的分支生物聚合物，与CMC的消耗率(Scheller和Ulvskov,2010)相比，它的消费率更高。
利用微藻生物量作为底物(He et al .，2016)，将微粒COD的溶解性作为实验的间接测量手段。在第一次和第二阶段，COD的溶解度没有明显的变化，只有第一个和第三个接种数据出现，其中的变化是显著的。3天后达到最大可溶性。生物量浓度的3.5 g L TS−1,第一次接种显示倾向于增加水解,ac -耶稣诞生颂的增量变化反映在可溶性COD(图2),0.30 g鳕鱼g-TS−1观察。从这个总COD版本,对应于碳水化合物,13%和60%,挥发性脂肪酸(vfa)(表1)。然而,第三个接种,年底有一个鳕鱼,减少由于可溶性物质的消费,如糖或浓度,以细菌所讨论的燧石et al .(2008)。更高的鳕鱼溶解得到7 g L TS−1的条件比降低微藻浓度(图2 b),达到0.42 g鳕鱼g TS−1。可溶性COD有类似糖和VFA成分比试验使用3.5 g L TS−1(分别为13%和43%)。在这两种方法中，醋酸是主要的VFA(高达50%)。在预处理后得到的高含量的COD是厌氧消化的合适基质(He et al .，2016)。
考虑到microalgal生物量的鳕鱼等效为1.82 g鳕鱼g TS−1微藻,最多水解效率为23%,获得了7 g L TS−1。这一研究获得的结果是略高于观察到小球藻文化的预处理与地衣芽孢杆菌(0.344 g鳕鱼g TS−1和一个60 h孵化时间)报道他et al。(2016)。在另一项研究中，利用纯酶和酶调式鸡尾酒的酶水解作用，在3小时的潜伏期(Mahdy et al .，2016)后，在水解效率上提高了20%。尽管使用反刍的文化可能需要比以前的工作时间更长，但使用水解细菌可能有利于利用商业酶，这些酶是他们不断增加的，并导致额外的成本。此外，第三种接种的水解活性的增加表明，在反复喂食后，可以及时保持预处理培养基。3.3。初始S / X比的影响
图3显示了微藻在不同初始S / X比值预处理后得到的结果。单因素方差分析表明，至少有两种治疗方法存在显著性差异(p = 0.016)，使用S / X比0.5的COD显著升高(29%水解效率)。此外,鳕鱼溶解最初的S / X 0.5是1.22和1.55倍的获得上一节(7 g L TS−1生物量和S / X 70)的比率。budiUNK et al .(2009)对不同的初始S / X比值(从1到4)进行了不同的ruminal液体和猪粪的测试，并评估了其对biogas生产的影响，发现使用较低的S / X比获得了最佳条件。本研究结果表明，初始S / X比值对COD的溶解度有显著影响(图3)。
S / X的可溶性部分测试是消化(表2)。观察到多达55%的理论甲烷产量(表2),假设完全生物降解COD来往——sponds 350毫升CH4 g鳕鱼−1(Angelidaki和桑德斯,2004)。可溶性组分的甲烷含量有限，可由蛋白质含量高(表2)解释，生成C / N比接近10;此外，厌氧消化的最佳C / N比是20 - 25(Yen和Brune,2007)。
在不同S / X比值的Gompertz参数中(表2)，单因素方差分析表明，只有特定的produc - tion率有显著的影响(p = 0.0005)。图4表明，随着衬底浓度的增加，甲烷的产生在-折痕。然而，考虑到COD的消耗，结果决定了S / X比的影响。当S / X比值降低时，速率增加，意味着更容易生物降解的污水产生于0.5和0.3的S / X比值。使用初始的S / X比值为0.5，可以去除高达88%的COD，而对1和0.3的S / X比值可以去除78%，2的比值为82%。
甲烷产量变化从155年到193毫升CH4 g鳕鱼−1(表2),产生最好的结果以及甲烷产率(3.65毫升CH4 g鳕鱼−1 h−1,表2)获得了S / X 0.5的比率。这些值与其他被报道的水解的Scenedesmus生物量相似。商业酶,例如,使用52%的生物降解性,(产量184毫升CH4 g鳕鱼−1)和62%(216毫升CH4 g鳕鱼−1)是实现当使用carbohydrolases和蛋白酶,分别(Mahdy et al .,2016)。当一个热预处理(90°C 1.5 h)是应用,甲烷产量170毫升CH4 g鳕鱼−1报道(González-Fernández et al . 2012 C)。最近的研究表明,甲烷产量可以提高利用瘤胃微生物培养液(Gimé游泳et al .,2017)。后者工作报告甲烷产量高达214毫升CH4 gCOD−1使用一个厌氧膜生物反应器。
生产力是任何过程的关键因素;赞成
可持续7天(3天以反刍液预处理3天，达到甲烷生产的sta -征伐期)。在这方面,这些结果3至4.7倍速度比那些报道其他方法,如热、生物和商业的水解细菌菌株酶预处理、甲烷动力学从22.5持续到33天(González-Fernández et al .,2012 c;他et al .,2016;Mahdy et al .,2016)。此外,产量至少2和4倍当使用厌氧和厌氧污泥bio-augmented瘤胃真菌(艾登et al .,2017)和瘤胃液体时用作产甲烷菌(Gimé游泳et al .,2017)。
Gimé游泳et al。(2017)表明,可以保持半连续系统利用瘤胃微生物生产我——领主的保留时间31天。这之前提到的工作和浓缩实验(第3.2节)表明，可以开发一种连续的系统来水解基于反刍流体的微藻，并保持稳定性。在这方面，需要长期的研究。
3.4。微生物群落分析
3.4.1。细菌群落的初始组成
为了识别细菌对瘤胃和原生微藻的贡献，细菌群落的特征，与第2.2.2节所报道的对照相比。与绵羊和奶牛不同的是，与绵羊和奶牛不同的是，与绵羊和奶牛不同的是，一般的纤维bacter和Ruminococcus的水解细菌在群落中占比不到0.1%，它们分别代表了3.5 - 18%和< 1.5 - 3.6%的群落- nities之间的差异(Petri et al .，2013)。这一群体组成的变化可能是由于不同的因素，如反刍动物的饮食(Petri et al .，2013)。其他相关的属，即它们的碳水解酶活性，分别是Paludibacter,Prevotella和UNK ricimonas，它们的相对丰度为33%(Flint et al .，2008;Koropatkin et al .,2012)。
在微藻生物量中，发现了很高比例的假单胞菌(88%)，其次是梭菌(5%)。细菌的
在厌氧条件下(Singh et al .，2016)，假单孢属在不含脂肪的抗肿瘤的com -磅，如cutin,lignin，烷烃或芳香化合物(在sporopollenins上的com -磅)中具有非常多的用途。此外,细菌属孤立在软体动物的自然降解微藻(Muñoz et al .,2014)。然而，在厌氧条件下，并没有关于假单菌活性的碳水解酶活性，这阻碍了藻生物量的自水解。在目前的工作,观察autohydrolysis只有0.091 g鳕鱼g TS−1,代表只有5%的颗粒鳕鱼和5.7倍低于测试S / X比率为0.5。此外，最近的研究表明，自水解对改善甲烷的恢复与原始的mi - croalgal生物量(Mahdy et al .，2016)没有任何关系。对使用原生微藻培养基中细菌群落的分析证实了非盟- to水解不是一种可行的预处理方法，因为它与相关的碳水解酶能力不相关。
在仅以瘤胃液为对照的孵育后，假单胞菌的相对丰度为54.5%，其次是蛹杆菌(10.6%)。在两种控制方法中，假单胞菌的丰富度(如反刍动物和微藻菌群)凸显了这个属(Singh et al .，2016)的普遍特征。在本研究中，在随后的以微藻文化为基础的反刍文化的丰富试验中，推测假单胞菌可能来自两种文化。
3.4.2。细菌群落的富集
尽管之前的研究使用了瘤胃微生物来消化米- cro藻类(Aydin et al .，2017;Gimé游泳et al .,2017),目前的工作描述了瘤胃细菌社区选择等基质及其对微藻水解的贡献。图5a显示了富集测试中OTUs的相对丰度，以及它们的相似性。聚类分析发现，在瘤胃内的初始细菌与能够适应xylan的细菌相似，这表明作为液体来源的牛的饮食富含半纤维素。这是有关事实,这些样品中含量最丰富的bac - teria细菌类的Bacteroidia(属拟杆菌、普氏菌和Paludibacter),特点是β-葡聚糖酶和淀粉酶活动(Flint et al .,2008)。另一种由xylan选择的羧酸酶活性的属，包括Klebsiella和6.4%的不动杆菌，属于Gammaproteobacteria类(Dantur et al .，2015;Pourramezan et al .，2012)，除了大量的发酵细菌(21.4%的肠杆菌)。
尽管在控制中选择的细菌群落仅包含微藻，但与以CMC(图5a)为基础的反刍性流体生长相似(图5a)，所选的属植物具有不同的水解活性。在这方面，在微藻的控制中，假单胞菌为88%，在CMC的培养基中，不动杆菌属主要属(占总数的51%)，其次是Comamonas(12.4%)和Clostridium(11.3%)。此前有报道称，属型不动杆菌和梭状芽孢杆菌具有CMCase活性(Pourramezan et al .，2012;特蕾西et al .,2012),尽管Comamonasβ-葡糖苷酶活性(曹et al .,2010)。
另一个集群是由细菌群落生长在microalgal生物质(3.5和7 g L TS−1),这是由于瘤胃细菌的浓缩的液体和microalgal在场的生物量。水解细菌选择最终化验为3.5 g L TS−1包括梭状芽孢杆菌(3.2%)、茎菌属(2.5%)、Bosea(2%)和Mesorhizobium(1.3%)(Jimé游泳et al .,2016;特蕾西et al .,2012),而7 g L TS−1,梭状芽孢杆菌(16%)是最丰富的属。相比之下,在细菌与木质素分解活动,Rhodobacter(1%)和增效剂(12.8%)被确定(辛格et al .,2016)的3.5 g和L−1;然而,当瘤胃液体与7 g和L−1孵化,假单胞菌,占主导地位的微生物群落,相对丰度高达25%。近年来,据报道,Mesorhizobium茎菌属属能够降解木质纤维素的物质(Jimé游泳et al .,2016)。从这个意义上说，Mesorhizo - bium属的成员有能力降解纤维材料，高于白腐菌毛霉或曲霉菌(Sethi et al .，2013)。从对照组的细菌群落分析中可以推断出，所选择的高水解活性的细菌(如Caulobacter和Mesorhizobium)来自于反刍动物。
3.4.3。S/ X对细菌群落的影响
一种由OTUs构成的热图和dendrogram
根据不同的S / X比值，得到的结果如图5b所示。在2的菌体和S / X比值的簇中，常见的细菌包括梭状菌，其特点是具有不同的碳水解酶活性(Tracy et al .，2012)。据推测，这些细菌在微藻细胞壁的水解过程中起着重要的作用。然而，这些细菌没有降解木质素类化合物的能力，这可能限制了微藻细胞壁的水解，因此导致了COD(和较低的甲烷回收)的溶解性较低，S / X比为2(图4)。
另一个确定的星团由藻类生物量的控制和S / X比值为0.3的测试组成。这些测试中的细菌群- nities几乎完全由假单胞菌属(高达96%)组成;这些细菌可以降解木质素,在软体动物中发现,降低微藻在自然栖息地(Muñoz et al .,2014)。然而，在0.3的S / X比值中，mi - cro藻类细胞壁的水解可能受到低car - bohydrolase活性的限制，因为Clostridia类与Bac - teroidia一起，只增加了13%的相对丰度。
由ruminal流体控制所选择的细菌群落和assays的S / X比为0.5和1，形成了第三个簇(图5b)，这些assays具有最佳的COD和甲烷收率。对于S / X比值，最丰富的水解活性的属为假单胞菌，其相对丰度为45.9%，其次为蛋白酶体(3.7%)，后一属的成员具有蛋白水解、甲壳素溶解和淀粉酶活性(Pikuta等，2009)。第三种被鉴定属梭状芽孢杆菌(2.7%)，具有降解各种结构多糖的能力(Tracy et al .，2012)。
在两种分析中，富集和不同的S / X比值有类似的细菌属的选择，假单胞菌和梭菌是最丰富的。在所有试验中发现的其他属类较少，包括Caulobacter,Meshorizobium,Bosea,Prevotella,Bacteroides和Tyzzerella，这些细菌具有降解结构多糖的能力(Flint et al .，2008;Jimé游泳et al .,2016),而最丰富的蛋白水解细菌Pro - teocatella(Pikuta et al .,2009)。
4。结论
以浓缩的瘤胃液作为水解微生物的来源，进行了原生微藻的预处理，并证明了进一步的甲烷生产。测定了在最高水解效率和甲烷收率条件下的最佳糜- croalga与反刍液比。水解和甲烷的产生需要7天的工艺时间。最丰富的瘤胃水解细菌是梭状芽孢杆菌和蛋白酶体。此外，还需要进一步研究mi - cro藻类在连续系统中的预处理，以优化操作参数，并对系统的稳定性进行评估。
确认
这项研究在经济上得到了SENER - CONACYT 249590、dgapa - unam(papi - in10i716)和cemie - bio集群生物燃料(Gaseosos 247006)的资助。我们认识到Ricardo Basurto Rodriguez博士给我们提供了在墨西哥的Queretaro的ruminal液体的接触。作者感谢Jaime Perez和Gloria Moreno的技术支持。
References
Angelidaki, I., Sanders, W., 2004. Assessment of the anaerobic biodegradability of mac- ropollutants. Rev. Environ. Sci. Biotechn. 3, 117–129.
Aydin, S., Yıldırım, E., Ince, O., Ince, B., 2017. Rumen anaerobic fungi create new op- portunities for enhanced methane production from microalgae biomass. Algal Res. 23, 150–160. http://dx.doi.org/10.1016/j.algal.2016.12.016.
APHA, Awwa, WFE,, 2005. Standard methods for the examination of water and waste- water, 21th ed. Washington, D.C., USA.
Brennan, L., Owende, P., 2010. Biofuels from microalgae—A review of technologies for production, processing, and extractions of biofuels and co-products. Renew. Sustain. Energy Rev. 14, 557–577. http://dx.doi.org/10.1016/j.rser.2009.10.009.
Budiyono, B., Seno, J., Sunarso, S., 2009. Influence of Inoculum Content on Performance of Anaerobic Reactors for Treating Cattle Manure using Rumen Fluid Inoculum. Int. J. Eng. Technol. 1, 109–116.
Caporaso, J.G., Kuczynski, J., Stombaugh, J., Bittinger, K., Bushman, F.D., Costello, E.K., Fierer, N., Peña, A.G., Goodrich, J.K., Gordon, J.I., Huttley, G.A., Kelley, S.T., Knights, D., Koenig, J.E., Ley, R.E., Lozupone, C.A., McDonald, D., Muegge, B.D., Pirrung, M., Reeder, J., Sevinsky, J.R., Turnbaugh, P.J., Walters, W.A., Widmann, J., Yatsunenko, T., Zaneveld, J., Knight, R., 2010. QIIME allows analysis of high- throughput community sequencing data. Nat. Methods. 7, 335–336. http://dx.doi. org/10.1038/nmeth.f.303.
Carrillo-Reyes, J., Barragán-Trinidad, M., Buitrón, G., 2016. Biological pretreatments of microalgal biomass for gaseous biofuel production and the potential use of rumen microorganisms: a review. Algal Res. 18, 341–351. http://dx.doi.org/10.1016/j. algal.2016.07.004.
Cea-Barcia, G., Buitrón, G., Moreno, G., Kumar, G., 2014. A cost-effective strategy for the bio-prospecting of mixed microalgae with high carbohydrate content: Diversity fluctuations in different growth media. Bioresour. Technol. 163, 370–373. http://dx. doi.org/10.1016/j.biortech.2014.04.079.
Chang, J.J., Lin, J.J., Ho, C.Y., Chin, W.C., Huang, C.-C., 2010. Establishment of rumen- mimic bacterial consortia: A functional union for bio-hydrogen production from cellulosic bioresource. Int. J. Hydrog. Energy 35, 13399–13406. http://dx.doi.org/ 10.1016/j.ijhydene.2009.11.119.
Cho, M.J., Kim, Y.H., Shin, K., Kim, Y.K., Kim, Y.S., Kim, T.J., 2010. Symbiotic adaptation of bacteria in the gut of Reticulitermes speratus: low endo-β-1,4-glucanase activity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 395, 432–435. http://dx.doi.org/10.1016/j.bbrc. 2010.04.048.
Ciudad, G., Rubilar, O., Azócar, L., Toro, C., Cea, M., Torres, Á., Ribera, A., Navia, R., 2014. Performance of an enzymatic extract in Botryococcus braunii cell wall disrup- tion. J. Biosci. Bioeng. 117, 75–80. http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiosc.2013.06.012.
Dantur, K.I., Enrique, R., Welin, B., Castagnaro, A.P., 2015. Isolation of cellulolytic bacteria from the intestine of Diatraea saccharalis larvae and evaluation of their ca- pacity to degrade sugarcane biomass. AMB Express. 5, 1–15. http://dx.doi.org/10.
106
M. Barragán-Trinidad et al.
Bioresource Technology 244 (2017) 100–107
1186/s13568-015-0101-z.
Demirbas, A., (2009). Biofuels, in: Demirbas, A. (Ed), Biofuels. Springer London, London,
pp. 87–101.
DuBois, M., Gilles, K.A., Hamilton, J.K., Rebers, P.A., Smith, F., 1956. Colorimetric
method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 28,
350–356. http://dx.doi.org/10.1021/ac60111a017.
Edgar, R.C., 2013. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon
reads. Nat. Methods 10, 996–998. http://dx.doi.org/10.1038/nmeth.2604. Edgar, R.C., 2010. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST.
Bioinformatics. 26, 2460–2461. http://dx.doi.org/10.1093/bioinformatics/btq461. Edgar, R.C., Haas, B.J., Clemente, J.C., Quince, C., Knight, R., 2011. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics 27, 2194–2200. http://dx.
doi.org/10.1093/bioinformatics/btr381.
Flint, H.J., Bayer, E.A., Rincon, M.T., Lamed, R., White, B.A., 2008. Polysaccharide uti-
lization by gut bacteria: potential for new insights from genomic analysis. Nat. Rev.
Microbiol. 6, 121–131. http://dx.doi.org/10.1038/nrmicro1817.
Gijzen, H.J., Zwart, K.B., van Gelder, P.T., Vogels, G.D., 1986. Continuous cultivation of
rumen microorganisms, a system with possible application to the anaerobic de- gradation of lignocellulosic waste materials. Appl. Microbiol. Biotechnol. 25, 155–162. http://dx.doi.org/10.1007/BF01982840.
Giménez, J.B., Aguado, D., Bouzas, A., Ferrer, J., Seco, A., 2017. Use of rumen micro- organisms to boost the anaerobic biodegradability of microalgae. Algal Res. 24, Part A, 309–316. http://dx.doi.org/10.1016/j.algal.2017.04.003.
Golueke, C.G., Oswald, W.J., Gotaas, H.B., 1957. Anaerobic digestion of algae. Appl. Microbiol. 5, 47–55.
González-Fernández, C., Sialve, B., Bernet, N., Steyer, J.P., 2012a. Impact of microalgae characteristics on their conversion to biofuel. Part I: Focus on cultivation and biofuel production. Biofuels Bioprod. Biorefining. 6, 105–113. http://dx.doi.org/10.1002/ bbb.338.
González-Fernández, C., Sialve, B., Bernet, N., Steyer, J.P., 2012b. Impact of microalgae characteristics on their conversion to biofuel. Part II: focus on biomethane produc- tion. Biofuels Bioprod. Biorefining 6, 205–218. http://dx.doi.org/10.1002/bbb.337.
González-Fernández, C., Sialve, B., Bernet, N., Steyer, J.P., 2012c. Thermal pretreatment to improve methane production of Scenedesmus biomass. Biomass Bioenergy 40, 105–111. http://dx.doi.org/10.1016/j.biombioe.2012.02.008.
He, S., Fan, X., Katukuri, N.R., Yuan, X., Wang, F., Guo, R.B., 2016. Enhanced methane production from microalgal biomass by anaerobic bio-pretreatment. Bioresour. Technol. 204, 145–151. http://dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2015.12.073.
Jiménez, D.J., de Lima Brossi, M.J., de, L., Schückel, J., Kračun, S.K., Willats, W.G.T., van Elsas, J.D., 2016. Characterization of three plant biomass-degrading microbial con- sortia by metagenomics- and metasecretomics-based approaches. Appl. Microbiol. Biotechnol. 100, 10463–10477. http://dx.doi.org/10.1007/s00253-016-7713-3.
Koropatkin, N.M., Cameron, E.A., Martens, E.C., 2012. How glycan metabolism shapes the human gut microbiota. Nat. Rev. Microbiol. 10, 323–335. http://dx.doi.org/10. 1038/nrmicro2746.
Lazuka, A., Auer, L., Bozonnet, S., Morgavi, D.P., O’Donohue, M., Hernandez-Raquet, G., 2015. Efficient anaerobic transformation of raw wheat straw by a robust cow rumen- derived microbial consortium. Bioresour. Technol. 196, 241–249. http://dx.doi.org/ 10.1016/j.biortech.2015.07.084.
Li, Y., Horsman, M., Wu, N., Lan, C.Q., Dubois-Calero, N., 2008. Biofuels from microalgae. Biotechnol. Prog. 24, 815–820. http://dx.doi.org/10.1021/bp070371k.
Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J., 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265–275.
Mahdy, A., Mendez, L., Tomás-Pejó, E., del Mar Morales, M., Ballesteros, M., González- Fernández, C., 2016. Influence of enzymatic hydrolysis on the biochemical methane potential of Chlorella vulgaris and Scenedesmus sp. J. Chem. Technol. Biotechnol. 91,
1299–1305. http://dx.doi.org/10.1002/jctb.4722.
Mahdy, A., Mendez, L., Ballesteros, M., González-Fernández, C., 2014. Enhanced methane
production of Chlorella vulgaris and Chlamydomonas reinhardtii by hydrolytic enzymes addition. Energy Convers. Manag. 85, 551–557. http://dx.doi.org/10.1016/j. enconman.2014.04.097.
McDougall, E.I., 1948. Studies on ruminant saliva. 1. The composition and output of sheep’s saliva. Biochem. J. 43, 99–109.
Miller, G.L., 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem. 31, 426–428. http://dx.doi.org/10.1021/ac60147a030. Muñoz, C., Hidalgo, C., Zapata, M., Jeison, D., Riquelme, C., Rivas, M., 2014. Use of
cellulolytic marine bacteria for enzymatic pretreatment in microalgal biogas pro- duction. Appl. Environ. Microbiol. 80, 4199–4206. http://dx.doi.org/10.1128/AEM. 00827-14.
Neuwirth, E. (2014). RColorBrewer: ColorBrewer Palettes. R package version 1.1-2. https://CRAN.R-project.org/package=RColorBrewer.
Petri, R.M., Schwaiger, T., Penner, G.B., Beauchemin, K.A., Forster, R.J., McKinnon, J.J., McAllister, T.A., 2013. Characterization of the core rumen microbiome in cattle during transition from forage to concentrate as well as during and after an acidotic challenge. PLoS ONE 8, 1–15. http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0083424.
Pikuta, E.V., Hoover, R.B., Marsic, D., Whitman, W.B., Lupa, B., Tang, J., Krader, P., 2009. Proteocatella sphenisci gen. nov., sp. nov., a psychrotolerant, spore-forming anaerobe isolated from penguin guano. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59, 2302–2307. http://dx. doi.org/10.1099/ijs.0.002816-0.
Pourramezan, Z., Ghezelbash, G.R., Romani, B., Ziaei, S., Hedayatkhah, A., 2012. Screening and identification of newly isolated cellulose-degrading bacteria from the gut of xylophagous termite Microcerotermes diversus (Silvestri). Microbiology 81, 736–742.
RStudio Team, 2016. RStudio: Integrated Development Environment for R. RStudio Inc., Boston, MA http://www.rstudio.com/.
Scheller, H.V., Ulvskov, P., 2010. Hemicelluloses. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 263–289. http://dx.doi.org/10.1146/annurev-arplant-042809-112315.
Singh, P.B., Saini, H.S., Kahlon, R.S., 2016. Pseudomonas: The Versatile and Adaptive Metabolic Network. In: Kahlon, R.S. (Ed.), Pseudomonas: Molecular and Applied Biology. Springer International Publishing, Ludhiana, pp. 81–126.
Sethi, R., Padmavathi, T., Sullia, S., 2013. Lignocellulose biomass degradation by marine microorganisms. Eur. J. Exp. Biol. 3, 129–138.
Staehelin, L.A., Pickett-Heaps, J.D., 1975. The ultrastructure of Scenedesmus (Chlorophyceae). I. Species with the “reticulate” or “warty” type of ornamental layer. J. Phycol. 11, 163–185. http://dx.doi.org/10.1111/j.1529-8817.1975.tb02765.x.
Takeda, H., 1996. Cell wall sugars of some Scenedesmus species. Phytochemistry 42, 673–675. http://dx.doi.org/10.1016/0031-9422(95)00952-3.
Tracy, B.P., Jones, S.W., Fast, A.G., Indurthi, D.C., Papoutsakis, E.T., 2012. Clostridia: the importance of their exceptional substrate and metabolite diversity for biofuel and biorefinery applications. Curr. Opin. Biotechnol. 23, 364–381. http://dx.doi.org/10. 1016/j.copbio.2011.10.008.
Van Soest, P.J., 1994. Nutritional Ecology of the Ruminant, 2nd ed. Cornell University Press, Ithaca, NY.
Warnes, G.R., Bolker, B., Bonebakker, L., Gentleman, R., Liaw, W.H.A., Lumley, T., Maechler, M., Magnusson, A., Moeller, S., Schwartz, M., Venables, B., 2016. gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data. R package version 3, 1.
Wehr, J.D., Sheath, R.G., 2003. Freshwater Algae of North America, Ecology and Classification, 1st ed. Academic Press, Amsterdam.
Yen, H.-W., Brune, D.E., 2007. Anaerobic co-digestion of algal sludge and waste paper to produce methane. Bioresour. Technol. 98, 130–134. http://dx.doi.org/10.1016/j. biortech.2005.11.010.
