引种紫锥菊烷酰胺类免疫调节作用
摘 要
目的：研究引种紫锥菊提取物烷酰胺类的免疫调节作用。方法：以小鼠脾淋巴细胞作为试验样本，设置0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL烷酰胺类浓度梯度，采用MTT法检测脾淋巴细胞增值的影响，ELISA法测定IFN-γ含量。结果：引种紫锥菊提取物烷酰胺类在0.01-10μg/mL浓度范围内能够刺激脾淋巴细胞的增殖，其浓度为0.1μg/mL时差异为极显著（p<0.01）。对脾淋巴细胞产生IFN-γ也表现出一定的促进作用，但差异不显著（P>0.05）。结论：引种紫锥菊提取物烷酰胺类具有免疫调节作用。
关键词：引种紫锥菊，免疫调节，T淋巴细胞，IFN-γ，
RESEARCH OF IMMUNOMODULATORY ON THE ALKYLAIDES FROM INTRODUCED ECHINACEA PURPUREA
Abstract：Objective Discuss the immune modulation of Introduction plant of Echinacea 。Methods The proliferation of murine spleen lymphocyte and the secretion of IFN 一γ were measured by MTT and ELISA assay to evaluate the immunomodulatory action 。Results Introduction plant of Echinacea extract of Alkylamides can enhance Con A stimulation of normal mice spleen lymphocyte proliferation, extremely significant difference compared with the control group (P < 0.01), the optimal concentration of 0.10μg/mL; IFN-γ on spleen lymphocytes also showed a certain role in promoting, but no significant difference compared with the control group (P > 0.05)。Conclusion Introduction plant of Echinacea extract of Alkylamides have immunomodulatory effect。
Keywords：Introduction plant of Echinacea，Immune一modulation，T-lymphocyte，IFN-γ
目录
绪论
免疫系统在人类和动物的机体中起重要作用。免疫系统的功能紊乱会产生多种疾病，威胁人们健康和生活质量。同样，在动物养殖业中，机体免疫功能障碍会产生很多疾病，并且，动物生产中长期应用抗生素、化学制剂和激素类饲料添加剂等，造成耐药性、药物残留、致癌、致畸变等问题，给养殖业和人类健康带来严重危害。因此，研究者们致力于疗效确切、安全稳定免疫调节剂的研究。目前使用的免疫调节剂主要有：微生物来源的制剂、人或动物免疫系统的产物、中药或天然药物有效成分、化学合成药物等。随着上世纪70年代人参烷酰胺类、香菇烷酰胺类等的免疫调节作用相继报道，使人们对从中药或天然植物中开发免疫调节药物产生了浓厚的兴趣。特别是在“回归自然、绿色消费”成为时尚的今天，天然植物药物理所当然地成为现代医疗保健的良好选择[1,2]。
目前，紫锥菊作为免疫调节剂在国际上受到普遍重视。在美洲作为免疫促进剂和免疫调节剂用于感冒和流行感冒的辅助治疗，在德国被推荐用于感冒、呼吸道和泌尿道慢性感染的辅助治疗，以及用于外伤感染、慢性溃疡的治疗。在提高免疫力方面，特别是在免疫力低下的状态比正常生理状态，紫锥菊表现出较为显著的免疫效果，如对人类的艾滋病、肿瘤等均有抑制病原和平衡机体免疫状态的效果。在国内，紫锥菊于上世纪70年代开始引入，尽管引种时间短，但各行业对其的研究进展均较快[3]。
国内紫锥菊的免疫调为开发引种的紫锥菊成为我国的一种新的药用植物资源，对紫锥菊提取物对小鼠单核巨噬细胞系统功能的影响进行了研究，结果显示紫锥菊提取物对正常小鼠的单核巨噬细胞系统功能都没有显著影响，但可增强小鼠抵抗氢化可的松引起的免疫抑制作用，说明该引种的紫锥菊有可能成为我国的一种新的药用植物资源，其氯仿提取物有可能被开发成一种免疫恢复剂 。兽药有很多都是从人药移植过来，通过相应的研究应用于畜牧业，更好的为人类提供健康、绿色的产品。基于此，很多研究者们对紫锥菊在畜牧业中的免疫调节作用做了较广泛的研究，主要集中于为人类提供食品的鸡和奶牛方面。紫锥菊在人类、畜牧业得到了广泛研究，但在水产养殖业方面研究较少。人类和畜牧业中对紫锥菊免疫调节的研究结果为紫锥菊在水产养殖中的应用研究提供参考[4]。
对于引种紫锥菊提取物的研究不少，但是对紫锥菊烷酰胺类免疫功能的未见报道。目前，青海地区尚未进行紫锥菊的栽培，本课题旨在研究引种青海紫锥菊烷酰胺类的免疫调作用。为紫锥菊提取物在青海省的研发提供有力的条件，开发免疫调节增强剂或保健食品提供重要依据，使紫锥菊这一闻名于世的免疫调节剂更好的为人类和各种养殖动物的健康服务。
第一章 体外试验
1.1材料方法
1.1.1试验动物
清洁小鼠，体重18～22g, 雌雄各半（西北农林科技大学实验动物中心提供）合格证号：4101150
1.2 试验材料与仪器
引种紫锥菊：北京南无科贸有限责任公司,原产地加拿大
- A(Con A):北京索莱宝生物有限公司
- (MTT):Sigma公司
- 培养基:赛默飞世尔生物化学制品公司
- :广东光华化学试剂厂产品
- ELISAIFN-γ检测试剂盒:有限公司产品
- 酶标仪:BIO-RAD公司产品
- :江苏姜堰公司产品
Allegra 64R高速冷冻离心机:Beckman公司产品
- 紫外分光光度计:Beckman公司产品
- :重庆光学仪器厂产品
- 高效液相色谱分析仪:Waters公司产品
- 培养箱,日本SANYO公司产品
1.3引种紫锥菊烷酰胺类的制备
根据参考文献[8，10]，将粗提物浸膏282g混悬于水中, 用10倍量95%EtOH超声提取三次,每次l h,合并提取液,回收EtOH,以热水溶解,CH3CL萃取三次,回收CH3CL置50℃浓缩干燥即得。经紫外分光光度法测定其烷酸胺类成分含量。
1.4试验方法
1.4.1引种紫锥菊的栽培
- 种子来源
种子购于北京南无科贸责任有限公司（原产地加拿大）
2.种植基地
青海大学农牧学院实习牧场
3.种植过程
2013年4月12日至2013年6月6日期间，温室育苗。
2013年6月7日，移栽。
4.试验处理
2013年6月18进行试验处理。将紫锥菊分为3组进行试验处理，每组8垄，每垄选6株，分别做对照组、施肥组、覆膜组。
不同处理采的植物样已按地上部分，地下部分分别处理，风干，准备烷酰胺类含量测定。
1.4.2样本的采集
取正常小鼠10只,雌雄各半,断颈处死小鼠,以75%酒精消毒皮毛后立即分离脾脏, 放入无菌RPMI一1640培养基中, 迅速转入超净工作台,剔除筋膜组织及结缔组织,逐次用过量双抗PBS,正常双抗PBS,无双抗PBS,无血清RPMI一1640培养基清洗,用无菌眼科剪将脾组织剪碎,无菌RPMI1640培养基冲洗剪碎的脾组织,反复操作,收集细胞悬液至离心管中自然沉降,弃去沉淀。取脾细胞悬液1500rpm离心5分钟。弃上清,用无血清RPMI一1640洗涤3次;收集脾细胞,加入0.83%的NH4CL 5mL,破除脾细胞悬液中的红细胞3分钟。加入含10%小牛血清的RPMI一1640培养基中止NH4CL破红细胞作用,以1500印m离心5分钟,收集沉淀,洗涤3次,即得脾淋巴细胞。离心弃上清,加入含10%小牛血清、5μg/mL Con A的1640培养基,调整细胞密度为3*105个细胞/孔,以180μL体积接种于96孔培养板,分别加入上述紫锥菊提取物20μL,起始浓度为100μg/mL,10倍连续稀释至0.01μg /mL,同时设置药物空白对照。加入药物后在37℃、完全饱和湿度、体积分数为5%的CO2孵箱中培养72小时。从孵箱中取出培养板,于高速冷冻离心机2500rpm离心3分钟,取培养的细胞部分用MTT法检测T淋巴细胞增殖情况【5,10】。
脾淋巴细胞的分离与检测流程如图1所示：
处死小鼠，分离脾脏
过量双抗PBS清洗
正常双抗PBS清洗
无双抗PBS清洗
无血清RPMI-1640清洗
无菌脾脏
用无菌剪刀剪碎，1640清洗
带组织块脾淋巴细胞
自然沉降，弃去沉淀
无组织块脾淋巴细胞
NH4CL破红细胞
脾淋巴细胞
细胞计数
接种、加药、孵育72小时
MIT法检测细胞增殖，ELISA法测定IFN-γ含量
图1
1.4.3 MTT法测定
MTT法测定T淋巴细胞增殖方法:取待测细胞,按10μL/孔 加入5mg/ml的MTT液,在37℃、体积分数为5%的CO2孵箱中培养4小时,轻轻吸取80μL上清液,弃去,按100μL /孔 加入酸化异丙醇,充分溶解,用Benchmark酶标仪于57Onm处测定其吸光度。参考文献[6,10] 。
1.4.4 IFN-γ的测定
参照试剂盒说明,用ELLSA法检测Con A刺激T淋巴细胞分泌INF一γ的水平。收集培养细胞上清液分别加入到INF一γ检测酶标板内,按试剂盒说明进行操作,反应终止后测定450nm波长下的吸光度,根据标准反应孔吸光度所得回归方程计算INF一γ的含量。参考文献[6,10]。
1.5结果分析
1.5.1 引种紫锥菊烷酰胺类的制备
经过经紫外分光光度法测定其烷酸胺类成分含量为12.36%。
1.5.2MTT法测定
引种紫锥菊提取物烷酰胺类对Con A刺激脾淋巴细胞增殖的影响试验结果见表1，图2。
表1 引种紫锥菊烷酰胺类对Con A刺激对脾淋巴细胞增殖的影响
|
药物浓度μg/mL |
OD570 |
|
0 |
0.021±0.015B |
|
0.01 |
0.278±0.019B |
|
0.1 |
0.313±0.021B |
|
1 |
0.294±0.018B |
|
10 |
0.302±0.024B |
注：Con A浓度：5μg/mL B:差异极显著p<0.01
图2
表1、图1结果表明,引种紫锥菊提取物在0.01-10μg/mL浓度范围内均能促进conA激活的正常小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖,与对照组比较均有极显著差异(P<0.01)。0.1μg/mL时最为显著，随后逐渐下降，证明其免疫调节作用取决于其浓度，过了适宜的浓度后作用逐渐下降。
1.5.3 IFN-γ的测定
引种紫锥菊提取物烷酰胺类对Con A刺激T淋巴细胞生成INF一γ的影响表2、图3见
表2 引种紫锥菊提取物烷酰胺类对Con A刺激T淋巴细胞生成INF一γ的影响
|
药物浓度μg/mL |
IFN-γ(pg/mL) |
|
0 |
42.89±20.12 |
|
0.01 |
92.12±34.76 |
|
0.1 |
98.73±29.06 |
|
1 |
105.34±36.25 |
|
10 |
97.64±37.88 |
注：Con A浓度：5μg/mL
图3
结果表明，引种紫锥菊烷酰胺类在0.01一10μg/mL浓度范围内均能促进Con A刺激的正常小鼠脾脏T淋巴细胞分泌IFN-γ，但效果不显著(P>0.05)。随着引种紫锥菊烷酰胺类浓度的升高，IFN-γ的生成量表现为先上升后下降的趋势，引种紫锥菊烷酰胺类浓度0.1μg/mL时，IFN-γ的生成量达到最大。
1.5.4统计学处理
全部数据采用SPSS13.0进行统计分析，应用ANOVA进行方差分析，应用DUNCAN程序的显著检验。各项指标以平均数±标准差（
）表示。
第二章 讨论
2.1 引种紫锥菊烷酰胺类含量
烷酰胺类化合物：紫锥菊的烷基酰胺类化合物具有免疫调节作用，还具有抗上呼吸道感染的作用。Vinti等的实验表明紫锥菊所含的烷基酰胺可以抑制5-脂氧合酶和环氧合酶的活性，从而增加NK细胞的数目[6]。本试验紫锥菊烷酰胺类含量测定值为12.36%，据报道[9]引种紫锥菊提取物烷酰胺类含量28.37%。，可能与西宁地区的气候、土壤、自然条件有关。
2.2 引种紫锥菊烷酰胺类对细胞增殖的影响
T淋巴细胞是免疫细胞的主要组成部分,在机体免疫应答中起着核心作用,T淋巴细胞的转化和增殖能力直接体现机体细胞免疫功能。本试验结果表明，引种紫锥菊提取物烷酰胺类在0.01-10μg/mL浓度范围内能够刺激脾淋巴细胞的增殖，与对照组相比，当浓度为0.1μg/mL时差异极显著（p<0.01）,表明引种紫锥菊具有增强细胞免疫功能的作用。这一试验结果在吴建明，邹文俊．引种紫锥菊主要活性部位的免疫调节作用研究得到验证[9],表明引种紫锥菊在体内仍具有免疫活性。该结果与Con A 诱导的淋巴细胞转化试验结果相互映证,表明引种紫锥菊具有增强机体细胞免疫功能的作用。
2.2 引种紫锥菊烷酰胺类对IFN-γ的影响
免疫干扰素即IFN-γ，主要由活化T淋巴细胞产生，在一定条件下也可由NK细胞产生，对免疫系统有调节作用，是哺乳动物主要的巨噬细胞活化因子。IFN-γ生物学作用有较严格的种属特异性，人IFN-γ只作用于人或灵长类动物的细胞。IFN一γ主要由活化的T细胞产生,其生物活性主要为抗病毒、抑制细胞增殖、激活巨噬细胞、促进Thl细胞分化、参与炎症反应[8]。本试验中,引种紫锥菊烷酰胺类在0.01一10μg/mL浓度范围内均能促进Con A刺激的正常小鼠脾脏T淋巴细胞分泌IFN-γ，但效果不显著(P>0.05), 由此，推断引种紫锥菊烷酰胺类对IFN-γ生成有影响。
参考文献
[1]肖培根.国际流行的免疫调节剂—紫锥菊及其制剂[J].中草药,1996,24(1):46-48
[2]马小军、王雅玲等.紫锥菊在北京地区的引种[J].中国中药杂志,199.924(10):590一592
[3]张莹,刘坷,吴立军.紫锥菊属药用植物研究进展[J].中草药,200L32(9):852一855
[4]刘一兵.紫锥菊属植物制剂的化学、免疫作用与临床[J].国外医药·植物药分册,2001.16(2):47·55
[5] Poksch A， Wanger H. Structral analysis of 4- o-methyl- glu-curonrarabinoxylan with immune stimulating activity from Echinacea purpurea[ J] . Phytochemisty. 1987，26: 1989-1993
[6] Luettig B.， Steinmu¨ller C.， Gifford GE.， Wagner H. and Lohmann-Matthes M.L.， Macrophage activation by the polysaccharide arabinogalactan isolated from plant cell cultures of Echinacea purpurea. J Natl Cancer Inst，1989；81: 669–675.
[7]Wagner H， Jurcic K. Immunological studies of plant extract combinations in vitro and in vivo studies on the stimulation of phagocytosis . Arzneim-Forsch 41:1072-1076，1991
[8] 吴江涛，刘珂．紫锥菊提取物对小鼠单核巨噬细胞系统功能的影响[J]，烟台大学学报(自然科学与工程版)2001，(14)131—134．
[9]吴建明，邹文俊．引种紫锥菊主要活性部位的免疫调节作用研究[J]，时珍国医国药，2009，20(4)：970—972．
[10]刘雪莲，引种紫锥菊免疫调节作用研究[D],成都医药大学，2006.
致谢
感谢吴华老师的信任与栽培，以及所有帮助过我的老师同学，谢谢你们让我有机会完成这个课题。让我不仅完成大学四年学业，也让我意识到我的不足与也认识到很多值得研究的领域等着我们去开拓。
同时也感谢国家自然科学会对本次课题的经济方面的支持。谢谢你们支持中国科学研研究的发
